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Avances en microscopía celular

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Avances en microscopía celular

Crédito: iStock

Todos sabemos que ver para creer. Esto ha llevado a los científicos a obtener imágenes de células con microscopios ya en 1658. 1 Desde entonces, la microscopía se ha modernizado significativamente y se ha convertido en una herramienta omnipresente en los laboratorios de biología celular con el uso de microscopía fluorescente y 3D.

¿Ver más significa creer más? Ciertamente, parece que hay un impulso para poder ver cada vez más con los últimos avances en imágenes celulares. También parece que la cantidad se puede combinar con la calidad: las herramientas de microscopio pueden ver a resoluciones más altaspara obtener más información con una precisión asombrosa y, lo que es más importante, en células vivas con perturbaciones mínimas. Ahora, los científicos pueden visualizar de forma rutinaria orgánulos individuales, mapear el movimiento de los loci cromosómicos, detectar fuerzas mecánicas y obtener imágenes de las células continuamente durante días de una manera de alto rendimiento.¡Siga leyendo para conocer cinco avances clave en microscopía celular para comprender hacia dónde se está moviendo el campo!

1. microscopía Brillouin


La microscopía Brillouin es un método no invasivo y sin etiquetas que puede probar las propiedades viscoelásticas de muestras biológicas con resolución limitada por difracción en 3D. 2 Tiene la ventaja de no tener contacto, a diferencia de la microscopía de fuerza atómica. Las propiedades mecánicas de las células y los tejidos a menudo se alteran en los tejidos enfermos y, por lo tanto, son de gran interés para la comprensión de los mecanismos subyacentes a las patologías. La dispersión de la luz de Brillouin gira en torno a la interacción deluz con fluctuaciones de densidad espontáneas inducidas térmicamente. Las propiedades mecánicas, como la rigidez, se pueden inferir de los cambios de frecuencia del espectro de luz dispersa. 2 Esto ha permitido numerosos tipos de mediciones biológicas, como el mapeo 3D de las propiedades biomecánicas intracelulares en células completas. 3 o la imagen del organoide intestinal en 3D. 2 Sin embargo, todavía quedan desafíos por resolver con esta técnica de microscopía, y los datos requieren una interpretación particularmente cuidadosa, ya que algunos han sugerido que las mediciones de Brillouin podrían estar dominadas por la hidratación y no por los efectos de rigidez. 4

2. Imágenes de fluorescencia marcadas con CRISPR


CRISPR sin duda ha revolucionado la edición y regulación de genes y, al hacerlo, también ha facilitado la microscopía celular. Los grupos lo han utilizado para etiquetar loci cromosómicos definidos para obtener imágenes de la estructura 3D del genoma en células vivas. 5 a diferencia de los estudios de hibridación in situ convencionales que muestran imágenes solo de células fijas. Usando Cas9 combinado con andamios de ARN de guía única sgRNA diseñados que unen conjuntos de proteínas fluorescentes, Ma et al. Recientemente lograron imágenes simultáneas de hasta seis loci cromosómicos encélulas vivas individuales, una técnica que llaman CRISPRainbow. En principio, explican que agregar un solo color más a CRISPRainbow aumentaría el número de detección simultánea de células vivas de loci genómicos a 15. 6

3. Microscopía de hoja de luz


La microscopía de fluorescencia de hoja de luz LSFM ilumina solo el plano focal de imágenes finas de una muestra y detecta la fluorescencia de este plano específico, minimizando así la fluorescencia desenfocada y el fotoblanqueo. 7 Esto significa que se puede observar la dinámica de organismos y células, sin la necesidad de seccionar una muestra. Hasta hace poco, la resolución no permitía obtener imágenes subcelulares en campos de visión lo suficientemente grandes como para contener varias células. De hecho, la heterogeneidad ópticade los tejidos puede causar aberraciones que comprometen rápidamente la resolución, la señal y el contraste con el aumento de la profundidad de la imagen. Se habían logrado avances con los haces de luz de Bessel y la lámina de luz de celosía, pero esta técnica seguía siendo compleja y costosa de configurar. En 2019, Chang et al..describió el nuevo método de síntesis de campo que facilita el uso de la lámina de luz con una óptica mucho más simple. 8 Combina LSFM con óptica adaptativa, que compensa las distorsiones ópticas cambiando la forma de un espejo para crear una distorsión igual pero opuesta. Requiere menos energía, minimiza el fotoblanqueo y permite la obtención de imágenes de varios colores al mismo tiempo a altaresolución. Esto permitió a Liu et al. obtener imágenes de endocitosis a lo largo del tiempo a nanoescala mediante la detección de la difusión de hoyos recubiertos de clatrina en un organoide derivado de células madre humanas o en la región de la cola dorsal de un pez cebra. 9 También les ayudó a visualizar con detalles exquisitos la dinámica de los orgánulos durante la embriogénesis del pez cebra y la migración celular en 3D de células neuronales, cancerosas o inmunes in vivo. Este avance promete revolucionar la biología celular subcelular cuantitativa en 4D.

4. Microscopía holo-tomográfica


La microscopía holo-tomográfica HTM es un método de microscopía de fase cuantitativa en el que el campo de onda complejo del objeto se codifica en un holograma y se combina con el escaneo rotacional de la muestra. 9 Esto da como resultado una reconstrucción 3D rápida de la distribución del índice de refracción de la muestra viva a una resolución por debajo del límite de difracción de la luz definido por el criterio de Rayleigh. Un activo clave de la técnica es la baja energía que transfiere a la muestra, lo que garantiza una baja fototoxicidad, lo que permitepara estudiar la dinámica subcelular sin perturbaciones. Ahora se han desarrollado sistemas sin dispersión que permiten obtener imágenes subcelulares de alta resolución, como la de las mitocondrias individuales que atraviesan ciclos de fusión y fisión. Con esta técnica, Sandoz et al.tiempo de giro de los organelos implicado en la reorganización celular antes de la mitosis en las células madre embrionarias de ratón mESC .80 minutos antes de la mitosis, observan el núcleo, los nucléolos, la membrana nuclear, las gotas de lípidos y la rotación de las mitocondrias, lo que sugiere un mecanismo potencial de redistribución de la célula.material antes de la división para ser investigado en estudios adicionales. 10

5. Microscopía de análisis de alto contenido


Ver más no se trata solo de alcanzar una alta resolución: también puede significar ver durante períodos de tiempo más largos. Los científicos se están dando cuenta de que la obtención de imágenes de células durante períodos cortos de tiempo o en puntos de tiempo discretos puede significar que se pierden una dinámica celular crucial.Es por eso que ahora se están desarrollando sistemas que permitan la obtención de imágenes continuas de las muestras. Por un lado, se están desarrollando algunos microscopios de manera que puedan integrarse dentro de incubadoras, para rastrear células en 2D a lo largo del tiempo a medida que crecen continuamente. De manera similar, algunas incubadorasse han diseñado para que contengan cámaras que puedan obtener imágenes de cualquier ensayo secuencialmente, para poder obtener imágenes de más de una muestra en la misma incubadora. Por otro lado, se están desarrollando sistemas de alto rendimiento para que muchos ensayos celulares en placas de pocillos puedanser estudiado durante mucho tiempo, en un esfuerzo por diseñar experimentos ricos en datos. Por ejemplo, Anastasov et al. cultivaron numerosos esferoides tumorales hechos de células cancerosas y estromales que fueron fotografiadas durante 14 días paraantificar su crecimiento bajo diferentes combinaciones de radiación y quimioterapia. 11 Esta configuración de alto contenido les permitió seleccionar un gran panel de agentes quimioterapéuticos y su combinación con radiación, identificando la vinblastina como un agente radio sensibilizador que es más eficiente para disminuir el tamaño de los esferoides en comparación con los ensayos en los que se usó vinblastina sola.

Referencias:


1. Hajdu SI. Una nota de la historia: El descubrimiento de las células sanguíneas. Ann Clin Lab Sci . 2003; 33 2: 237-238.

2. Prevedel R, Diz-Muñoz A, Ruocco G, Antonacci G. Brillouin microscopy: ¿una herramienta revolucionaria para la mecanobiología? arXiv: 190102006 [física] . Publicado en línea el 7 de enero de 2019. Consultado el 18 de junio de 2021. http://arxiv.org/abs/1901.02006

3. Antonacci G, de Turris V, Rosa A, Ruocco G. La microscopía Brillouin de deflexión de fondo revela la biomecánica alterada de los gránulos de estrés intracelular por la proteína ELA FUS. Biol comun . 2018; 1 1: 1-8. Doi : 10.1038 / s42003-018-0148-x

4. Wu PJ, Kabakova IV, Ruberti JW, et al. El contenido de agua, no la rigidez, domina las mediciones de espectroscopía de Brillouin en materiales hidratados. Métodos Nat . 2018; 15 8: 561-562. Doi : 10.1038 / s41592-018-0076-1

5. Chen B, Gilbert LA, Cimini BA, et al. Imágenes dinámicas de loci genómicos en células humanas vivas mediante un sistema CRISPR / Cas optimizado. celda . 2013; 155 7: 1479-1491. Doi : 10.1016 / j.cell.2013.12.001

6. Ma H, Tu LC, Naseri A, et al. Etiquetado multiplexado de loci genómicos con dCas9 y sgRNA diseñados mediante CRISPRainbow. Nat Biotechnol . 2016; 34 5: 528-530. Doi : 10.1038 / nbt.3526

7. Forero-Shelton M. Es más fácil mirar dentro de las celdas a alta resolución. Métodos Nat . 2019; 16 4: 293-294. Doi : 10.1038 / s41592-019-0373-3

8. Chang BJ, Kittisopikul M, Dean KM, Roudot P, Welf ES, Fiolka R. Generación universal de hojas de luz con síntesis de campo. Métodos Nat . 2019; 16 3: 235-238. Doi : 10.1038 / s41592-019-0327-9

9. Liu TL, Upadhyayula S, Milkie DE, et al. Observación de la célula en su estado nativo: imagen de la dinámica subcelular en organismos multicelulares. ciencia . 2018; 360 6386. Doi : 10.1126 / science.aaq1392

10. Sandoz PA, Tremblay C, Equis S, et al. El análisis 3D sin etiquetas de orgánulos en células vivas por índice de refracción muestra orgánulos premitóticos girando en células madre de mamíferos. bioRxiv . Publicado en línea el 4 de septiembre de 2018: 407239. Doi : 10.1101 / 407239

11.
Anastasov N, Höfig I, Radulović V, et al. Un cribado fenotípico basado en microtissue 3D de células tumorales resistentes a la radiación con tratamiento quimioterapéutico sincronizado. cáncer de BMC . 2015; 15 1: 466. Doi : 10.1186 / s12885-015-1481-9
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