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Avances en la detección de anticuerpos

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Avances en la detección de anticuerpos

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Los anticuerpos terapéuticos tienen un gran potencial para revolucionar la medicina, pero encontrar los anticuerpos candidatos adecuados que funcionen bien contra un objetivo y sean susceptibles de fabricación a gran escala puede ser un desafío. En este artículo, exploramos los desarrollos recientes en la detección de anticuerpos que pueden rápidamenteidentificar y priorizar anticuerpos para un mayor desarrollo.

Desafíos en el descubrimiento de anticuerpos


Cuando se realizan pruebas de detección de anticuerpos, los investigadores buscan una variedad de atributos. Básicamente, el anticuerpo debe unirse a su objetivo previsto, pero, según su propósito, también son necesarias otras características. Por ejemplo, los anticuerpos antivirales no debensolo se unen pero también neutralizar su objetivo viral y, a menudo, como se ve actualmente con la pandemia del SARS-CoV-2 COVID-19, deben tener una reacción cruzada contra muchas variantes virales diferentes. En la búsqueda de nuevos anticuerpos terapéuticos contra el cáncer,es esencial determinar si el anticuerpo tiene la función agonista o antagonista deseada cuando se une a su receptor diana.

“La falta de enlace no específico también es importante”, explica Brandon DeKosky , profesor asistente de química farmacéutica e ingeniería química en la Universidad de Kansas, quien recientemente desarrolló un nuevo método para detectar millones de anticuerpos humanos naturales. “No desea un anticuerpo que se una de manera no específica a células o tejidos humanos. Puede ser un gran problema de desarrollo de fármacos para anticuerpos con muchas cargas positivas o regiones hidrofóbicas que conducen a interacciones no deseadas ".

Llevar a cabo estudios funcionales adicionales sobre anticuerpos para demostrar que hacen más que simplemente unirse a su objetivo puede llevar mucho tiempo y recursos. No es de extrañar entonces que las nuevas formas de identificación o detección de anticuerpos terapéuticos se centren en predecir, o inclusomodelado: las propiedades de los anticuerpos lo antes posible en el proceso de descubrimiento.

Extracción automatizada de ácidos nucleicos y configuraciones de RT-PCR para pruebas de SARS-CoV-2

Para prevenir nuevas infecciones por COVID-19 en China una vez que disminuyó el número de casos, se realizaron pruebas a todos los ciudadanos que regresaban de otros países. Este proceso requirió pruebas rápidas y automatización del proceso de preparación de muestras. Para cumplir con estos requisitos, los científicos han aprovechadosoluciones de pipeteo automático. Descargue esta nota de la aplicación para descubrir un procedimiento de pipeteo para la extracción automatizada de ácido nucleico y RT-PCR con consejos sobre cómo automatizar el proceso de prueba de COVID-19.

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Acelerando el descubrimiento de anticuerpos terapéuticos


adentro laboratorio de DeKosky , en colaboración con investigadores del Centro de Investigación de Vacunas de los Institutos Nacionales de Salud NIH y UT-Austin, han desarrollado una prueba de detección de anticuerpos que es tan rápida como los métodos tradicionales pero que refleja mejor la inmunidad humana natural. 1

“Cada célula B tiene su propio anticuerpo único, compuesto por proteínas de cadena ligera y pesada codificadas por dos genes separados que se encuentran en diferentes cromosomas”, explica DeKosky. “Es como tener todas las páginas pares de un libroen una parte de la celda y los números impares en otra parte. Para leer la historia completa, debes conectar las páginas pares e impares ”.

Durante su doctorado en el laboratorio de George Georgiou , DeKosky desarrolló una forma de unir las cadenas ligeras y pesadas juntas para que pudieran secuenciarse, y ahora lo han incorporado en un método de detección. Los polipéptidos de anticuerpos de origen natural ligados se clonan en vectores de presentación de levadura y luego se usan como bibliotecapara detectar antígenos. Los esfuerzos anteriores en el descubrimiento de anticuerpos se basaban en la clonación de una sola célula, que tenía altos costos y se limitaba a detectar solo una pequeña fracción de todos los anticuerpos humanos. Otros métodos han vinculado pares no naturales de genes de anticuerpos, peroestos también tienen limitaciones.

“El emparejamiento de genes no naturales se ha utilizado en el pasado porque es mucho más fácil de hacer, pero a menudo la calidad de los anticuerpos descubiertos no es lo suficientemente buena para un fármaco eficaz, y la naturaleza sintética de esos anticuerpos hace que sea difícil de entenderla respuesta inmune humana ", dice DeKosky. Por el contrario, el emparejamiento nativo de anticuerpos para la detección significa que los anticuerpos se pueden identificar a medida que ocurren de forma natural, lo que ayuda a identificar los anticuerpos más potentes y revela más sobre la respuesta inmune humana. El equipo ha utilizado eltécnica para encontrar potentes anticuerpos contra el VIH, el Ébola y, más recientemente, el SARS-CoV-2.

Logre una cuantificación sólida de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos

Una etapa importante en el desarrollo de mAbs terapéuticos es la caracterización de su efecto sobre la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos ADCP. Sin embargo, esto puede ser un desafío ya que las técnicas convencionales para medir la ADCP pueden tener flujos de trabajo complejos y que requieren mucho tiempo, fijación prolongadaprotocolos, problemas de cuantificación, etc. Descargue esta nota de la aplicación para descubrir un ensayo multiplex de alto rendimiento que puede perfilar grandes bibliotecas de mAbs por sus efectos en ADCP en un tiempo mínimo y mucho más.

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Detección de objetivos desafiantes


Uno de los objetivos del descubrimiento de anticuerpos terapéuticos es encontrar anticuerpos solubles que logren un fenotipo deseado contra un objetivo de mamífero en su forma natural. En el
laboratorio de Lerner en el Instituto Scripps , están desarrollando nuevas formas de estudiar la unión de anticuerpos y su función en un entorno más natural. Uno de sus enfoques es utilizar pequeñas vesículas generadas por microfluidos para atrapar un anticuerpo y su molécula objetivo en las proximidades. Cada gota se convierte en un mini ecosistemaen el que las bacterias producen fagos que muestran un anticuerpo único, que solo puede interactuar con células de mamíferos en la misma gota. 2

Jia Xie, quien trabaja en el laboratorio de Lerner y como profesor asociado en la Universidad de Miami, explica este enfoque: “Queríamos mantener los anticuerpos en su formato soluble, restringir la difusión del anticuerpo y aumentar su densidad local, entoncespuede detectar la unión y analizar fácilmente el anticuerpo de unión de la vesícula. Con la mini vesícula, tiene un microambiente artificial y los anticuerpos se pueden generar a mayor velocidad y calidad ".

Otro problema es encontrar anticuerpos contra objetivos más desafiantes, como los receptores en la superficie celular. Esto ha resultado particularmente difícil para los receptores acoplados a proteína G GPCR y los canales iónicos. Sin embargo, estos objetivos generalmente conducen a medicamentos altamente efectivos, y explicanpara alrededor del 60% de los objetivos farmacológicos actuales.

“Es más difícil generar anticuerpos contra los GPCR o canales iónicos porque tienden a tener un dominio extracelular relativamente pequeño, lo que significa que hay poco antígeno para usar”, explica Xie. “Tampoco se puede eliminar una parte del ectodominioporque altera la conformación y es posible que los anticuerpos resultantes no reconozcan el receptor en su forma natural ”.

Para remediar esto, el laboratorio de Lerner ha desarrollado una pantalla en la que una biblioteca de anticuerpos de levadura y células de mamíferos que llevan el receptor de membrana se marcan con fluorescencia y luego se mezclan. Cuando un anticuerpo se une al receptor, forma un complejo de células de levaduraque se pueden clasificar mediante citometría de flujo. Con este enfoque, lograron realizar múltiples exámenes utilizando diferentes propiedades de activación de citometría de flujo para identificar anticuerpos con la mayor afinidad por un receptor. También utilizaron la técnica para identificar anticuerpos con afinidades de unión nanomolar para el ser humanoreceptor opioide mu, un objetivo importante que pertenece a la clase GPCR.
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Análisis de afinidad para detección y caracterización aceleradas de moléculas de plomo

Determinar la cinética de unión de una molécula líder y su afinidad con un objetivo es un paso crítico en el descubrimiento y desarrollo de productos biológicos. Este proceso justifica la necesidad de instrumentos analíticos capaces de caracterizar tales moléculas. Descargue este documento técnico para descubrir un enfoque que mide con precisiónmúltiples interacciones de alta afinidad a lo largo de tiempos de ejecución prolongados, logra una detección rápida de grandes bibliotecas y minimiza la pérdida de muestras preciosas.

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Predecir la idoneidad de los anticuerpos


Incluso una vez que encuentre un anticuerpo con la especificidad y función deseadas, entonces debe ser adecuado y lo suficientemente estable para la producción comercial a gran escala. Aquí es donde se vuelve importante poder predecir las propiedades de los anticuerpos lo antes posible,dice el profesor David Brockwell del Centro Astbury de Biología Estructural en la Universidad de Leeds, Reino Unido.

“Una de las diferencias clave entre las moléculas pequeñas y las moléculas de proteína grandes es que las moléculas de proteína grandes pueden desplegarse o doblarse mal porque son inherentemente inestables. Evaluar cuáles de estas moléculas complejas se pueden fabricar a escala es muy costoso porque es difícilpara predecir cuál tendrá éxito. Hemos estado analizando pruebas que podemos aplicar a las proteínas al principio del desarrollo para garantizar que tengan las propiedades adecuadas. Algunas personas en diferentes industrias lo llaman "calidad por diseño", pero en el contexto farmacéutico lo llamamoses "capacidad de desarrollo".

Brockwell y colaborador Profesora Sheena Radford han estado trabajando con Big Pharma en la capacidad de desarrollo de terapias con anticuerpos. Juntos, han desarrollado un ensayo que puede detectar proteínas que parecen tener probabilidades de agregarse y aquellas que son más resistentes, un desafío clave en la fabricación de anticuerpos terapéuticos.la pantalla utiliza beta-lactamasa como un "sensor" para detectar la agregación.

“La idea general es que si una proteína es inestable, se despliega y luego se agrega o se degrada y, al hacerlo, las dos partes de la proteína beta-lactamasa se desmoronan y las bacterias no sobrevivirán en elpresencia de ampicilina. Es probable que las proteínas que logran mantener unida a la betalactamasa y crecer en presencia de ampicilina sean más estables ”, dice Brockwell.

La técnica se probó en un experimento de prueba de concepto con un anticuerpo cuyo desarrollo se detuvo porque se agregó. 4 “La agregación se debió a un trío de aminoácidos que causó un parche hidrofóbico expuesto”, señala Brockwell. Cuando se reemplazaron los residuos, se resolvió por completo el problema, pero parece que requiere mucho tiempo y recursos para resolverlo.les mostramos los resultados de esta proteína en nuestro ensayo, todos quedamos asombrados. Estaba realmente claro que se podía diferenciar entre la versión pegajosa de la proteína y la alternativa no pegajosa ".

Un aspecto interesante de esta pantalla es el potencial para llevar a cabo una evolución dirigida de anticuerpos, explicó Brockwell: “Demostramos que podíamos tomar su anticuerpo descontinuado y sin perder mucho tiempo podíamos generar anticuerpos que eran mejores que los de repetición.diseño de reemplazo. Mutamos aleatoriamente los fragmentos de anticuerpos originales y luego seleccionamos solo aquellas bacterias que pueden crecer en altas concentraciones de ampicilina para encontrar las que tienen menos probabilidades de agregarse. Cuando clonamos los fragmentos en un anticuerpo IgG completo, demostramos que todavía teníanbuenas propiedades físicas y aún se unen a su antígeno diana ”.

La siguiente etapa es generar muchos más datos sobre la comprensión de por qué ciertos anticuerpos son propensos a la agregación. "Para eso, estamos usando bibliotecas de anticuerpos con mutaciones en cada variante, y luego seguimos su crecimiento en ampicilina a lo largo del tiempo.secuenciación de próxima generación en los clones de anticuerpos en el tiempo cero, y luego, en una etapa posterior, puede conectar los grandes conjuntos de datos de secuencia a una computadora y usar inteligencia artificial para realmente comenzar a comprender las reglas de agregación de proteínas: ¿qué tiene esta secuenciaque permite este comportamiento? Poder hacer eso sería verdaderamente transformador ".

Referencias


1.
Wang B, DeKosky B, Timm M. et al. Interrogación funcional y extracción de repertorios de anticuerpos VH: VL humanos emparejados de forma nativa. Nat Biotechnol 2018; 36,152–155. Doi : 10.1038 / nbt.4052

2. Tianqing Zheng T, Xie J, Yang Z, et al. Selección de anticuerpos mediante cocultivo clonal de Escherichia coli y células eucariotas en miniecosistemas. Proc Natl Acad Sci 2018; 115 27: E6145 – E6151. Doi : 10.1073 / pnas.1806718115

3. Yang Z, Wan Y, Tao P, et al. Un formato de interacción célula-célula para la selección de anticuerpos de alta afinidad a proteínas de membrana. Proc Natl Acad Sci 2019; 116 30: 14971–14978. Doi : 10.1073 / pnas.1908571116

4. Ebo JS, Saunders JC, Devine PWA, et al. An in vivo plataforma para seleccionar y desarrollar proteínas resistentes a la agregación. Nat Commun 2020; 11: 1816. Doi : 10.1038 / s41467-020-15667-1

Conozca al autor
Joanna Owens, PhD
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