Hemos actualizado nuestro Política de privacidad para aclarar cómo usamos sus datos personales.

Usamos cookies para brindarle una mejor experiencia. Puede leer nuestro Política de cookies aquí.

Publicidad
artículo

Criopreservación: aplicaciones y avances

artículo

Criopreservación: aplicaciones y avances

tiempo de lectura :

La criopreservación ha sido el método principal para preservar muestras biológicas durante muchos años. Ha permitido a los investigadores utilizar muestras raras o valiosas de hace décadas para responder a nuevas preguntas de investigación. Hoy en día se utiliza para preservar los últimos modelos de células complejas para que otros científicos los utilicenen el futuro y es esencial para el almacenamiento y suministro de tratamientos biológicos. En este artículo, exploramos los desafíos de la criopreservación y los avances emergentes que podrían mejorar estos métodos.

¿Qué es la criopreservación?


Cryo es la palabra griega para "escarcha" y criopreservación literalmente implica congelar células, tejidos, órganos o cualquier otro material biológico a temperaturas muy bajas.

Hay algunas formas de lograr esto: el enfoque más común utilizado en los laboratorios de investigación es congelar las muestras a –80 ° C usando CO sólido 2 o −196 ° C usando nitrógeno líquido. Pero un método llamado vitrificación se usa para congelar muestras clínicas como esperma, óvulos fertilizados o tejido ovárico para almacenamiento a largo plazo. La principal diferencia es que los métodos tradicionales de crioconservación permiten que se forme hielo duranteel proceso de conservación, mientras que en la vitrificación toda la solución se solidifica sin ninguna cristalización de hielo. 1 En este artículo nos centraremos en la criopreservación convencional más utilizada en los laboratorios.

Aplicaciones de la criopreservación


La criopreservación tradicional es un método muy eficaz para almacenar células y tejidos, que funciona manteniendo las células en "animación suspendida", como Sameena Iqbal , explica el gerente de recursos biológicos del Instituto Wellcome Sanger. "Al congelar las células, se detiene la actividad metabólica y se conservan los compuestos dentro de las células, como las enzimas".

Sin criopreservación, debe mantener las células y los tejidos vivos en cultivo continuo, lo que significa cultivarlos y dividirlos para generar más células lo que se denomina paso. Pero las células cambian a medida que se multiplican con el tiempo y esto puede hacer que pierdan características importantes.al congelarlos, reduce la heterogeneidad que de otro modo se introduciría pasándolos repetidamente.

“Desde nuestra perspectiva, la criopreservación nos permite almacenar nuevos modelos celulares para la comunidad de investigación a los que la gente puede volver en los próximos años”, dice Dra.Charlotte Beaver , director científico senior del Instituto Wellcome Sanger que desarrolla sistemas de modelos celulares complejos, como los organoides. “Significa que podemos mantener el modelo a largo plazo, pero no se están dividiendo continuamente hasta el punto en que han mutado apenasrepresentan las celdas con las que comenzaste ".

Un área donde la criopreservación se está volviendo cada vez más importante es en campo emergente rápidamente de terapias basadas en células: por ejemplo, preservación de células madre mesenquimales para un trasplante, o células T receptoras de antígeno quimérico células CAR T para tratar el cáncer. Con la terapia con células CAR-T, las células T de un paciente se eliminan, se vuelven adiseñado para reconocer antígenos como los antígenos asociados a tumores y luego devolvérselos. "Tienes que hacer mucho procesamiento en estas células, potencialmente moviendo las células entre sitios, obteniéndolas del paciente cuando las donan ael laboratorio, y luego de nuevo al paciente, y las células pueden degradarse muy fácilmente ”, explica Profesor Matthew Gibson , científico de biomateriales de la Universidad de Warwick. “Los tratamientos como estos idealmente necesitan congelarse en un formato que le permita descongelarlos rápidamente al lado de la cama y luego administrarlos a los pacientes. Tan pronto como tenga que procesar mucho en unen el entorno hospitalario, eso crea una barrera y todos estos pasos introducen un gran costo. De todos modos, estas son terapias extremadamente costosas, por lo que cualquier cosa que haga que ese proceso sea más eficiente y tenga como resultado la recuperación de más células sanas después de la congelación es bueno para el paciente ".

Almacenamiento criogénico de cultivos de células animales

Mantener cultivos celulares sanos y en crecimiento es una tarea exigente que se complica por el riesgo siempre presente de que se pierdan por accidentes o contaminación. Estos problemas se pueden reducir mediante el uso de la preservación criogénica, un proceso que efectivamente pone a las células en una verdadera animación suspendida.. Descargue esta guía para descubrir los eventos intracelulares y extracelulares durante la congelación celular y las ventajas de congelar cultivos celulares.

Guía de descarga

Limitaciones de la criopreservación


Una de las principales limitaciones de los métodos de crioconservación actuales es la tasa de recuperación de las células después de la congelación. Y mientras está en un proyecto de investigación, es posible que tenga tiempo para esperar a que sus células aumenten en número, para aplicaciones clínicas como las mencionadas anteriormente, estesimplemente no es posible.

Durante el proceso de congelación, los cristales de hielo se forman dentro de la muestra y dañan las células y algunas de las células nunca se recuperan. La mayoría de los protocolos clínicos y de laboratorio utilizan crioprotectores para proteger las células de los cristales de hielo y / o congelación y descongelación de velocidad controlada para evitar choqueslas células con cambios bruscos de temperatura.

Hay muchos crioprotectores diferentes disponibles, pero el crioprotector más común utilizado para células y tejidos de mamíferos es el dimetilsulfóxido DMSO. Otras opciones incluyen glicerol para células bacterianas y glóbulos rojos. Pero los crioprotectores tienen sus propios inconvenientes; el DMSO se considera elmejor protector, pero a ciertas concentraciones es tóxico para las células
. El glicerol es más amable con las células pero menos eficaz como crioprotector en comparación con el DMSO. 2 Una forma de mitigar los posibles problemas de toxicidad es utilizar diferentes combinaciones de agentes crioprotectores, como complementar una concentración más baja de DMSO con glicerol o polipropilenglicol. 2

También hay algunos tipos de células primarias a las que simplemente no les gusta estar congeladas en soluciones crioprotectoras, lo que puede representar un desafío. “Las células mononucleares periféricas de la leucemia mieloide aguda son mucho más fáciles de congelar y recuperar que las células del linfoma, por lo que si está congelandomuestras en las que aún no se sabe cuál es la malignidad, entonces es necesario tratarlas con mucho cuidado ", explica Iqbal." Del mismo modo, los diferentes tipos de células sanguíneas sanas se congelan de manera diferente: las células T pueden recuperarse bien, aunque su funcionalidad puede verse comprometida,mientras que los granulocitos no se recuperarán en absoluto ".

“Con modelos nuevos y complejos como los organoides derivados de una muestra de un paciente, corremos el peligro de perder modelos”, explica Beaver. “Una de las ventajas de usar organoides es que están compuestos por diferentes poblaciones de células que representan la heterogeneidad natural queves dentro de un tejido o tumor. La congelación los pone a través de un cuello de botella y si ese cuello de botella es demasiado severo para algunas de las células, pierdes esa heterogeneidad y ya no es un modelo tan bueno ".

Otra consideración es el uso final de la muestra. Por ejemplo, el ARN es mucho más sensible a los cambios de temperatura que el ADN genómico, como dice Beaver: “La gente ha desenterrado esqueletos de hace años y todavía logró secuenciar todo el ADN, mientras queEl ARN se degradará si está en un congelador de - 80 ° C que se ha abierto demasiadas veces ”. Esto plantea un problema para congelar las muestras si aún no sabe cómo planea usarlas.

“Si tiene un tejido muy limitado, debe decidir cuál es la mejor manera de preservar este material a medida que mejoran los métodos de análisis”, dice Iqbal. “Recuerdo que cuando comencé probablemente hace 18 años,obtener biopsias de ganglios linfáticos muy grandes con más tejido del que posiblemente podríamos usar, por lo que pudimos preservar de múltiples maneras, mientras que ahora las biopsias centrales son frecuentes para el diagnóstico y, por lo tanto, tiene material muy limitado para preservar con fines de investigación ".

Conceptos básicos de la criopreservación celular

La criopreservación se ha convertido en una práctica de rutina en la investigación biomédica y la medicina clínica. Cuando se congelan y se mantienen adecuadamente, las muestras pueden permanecer en un estado de metabolismo celular suspendido indefinidamente y se pueden descongelar según sea necesario. Para obtener los beneficios de este proceso, es importantepara tener un conocimiento profundo de los aspectos clave de la criopreservación. Descargue esta guía sobre los conceptos básicos de la criopreservación celular para investigación y uso clínico.

Guía de descarga

Avances en criopreservación


Hay dos avances principales que podrían mejorar la criopreservación, dice Beaver. "La automatización de rango medio es lo que falta en el mercado. Incluso si solo está congelando de 30 a 50 viales de algo, y no necesariamente todos los días, todavía esergonómicamente un desafío para las personas en el laboratorio ”. Y además de los robots, la otra área que se debe mejorar es encontrar alternativas al DMSO, que puede ser tóxico para las células. El suero fetal bovino se usa a menudo con DMSO para proporcionar proteínas que respaldan aún más elPero estos no son ideales para congelar células madre, por ejemplo. "No tiene sentido tener células vivas si se han diferenciado por la ruta que usted no desea. Y si está inyectando estas células de nuevo en estospersonas, por ejemplo, para un trasplante de células, entonces necesitaría un reemplazo de suero que no sea de origen animal ”.

“La criopreservación basada en DMSO es un método excelente, pero realmente debemos pensar en la eficiencia de las cosas”, coincide Gibson.de esas células después de la congelación. Si podemos aumentar ese número, entonces podemos eliminar lotes más pequeños del congelador, o si usamos células raras o células primarias que son más difíciles de cultivar y expandir, entonces cuanto más recuperes, más rápidopuede hacer su investigación, o cuantos más experimentos pueda hacer por lote ".

Para abordar esta necesidad, Gibson está investigando materiales biomiméticos, y una de las proteínas en las que han estado trabajando para imitar se llama proteína anticongelante o proteína de unión al hielo. 3 "Estas son proteínas que de alguna manera logran unirse selectivamente al hielo. Pueden distinguir entre el agua líquida y el agua congelada, es bastante notable". Estas proteínas que se unen al hielo son producidas por una gran variedad de especies, la más famosa de los peces que se encuentranen los polos de la Tierra. Las proteínas se unen a los cristales de hielo para detener su crecimiento, de modo que los peces puedan sobrevivir a temperaturas más bajas que los peces sin las proteínas. "Resulta que hay bastantes proteínas y polisacáridos que producen o detienen la formación de hielo o controlan cómoy cuando se forma. Si podemos imitar eso con polímeros sintéticos, entonces podríamos cambiar la forma en que congelamos las células inspiradas en cómo la naturaleza se protege durante el frío ”. El equipo ya ha demostrado que pueden usar los polímeros para reducir la cantidad de crioprotector mientrascongelación de células bacterianas. 4

Otro avance sería poder congelar las células que ya están adheridas a las placas de cultivo de tejidos, dice Gibson. “Con las células en suspensión, debe colocarlas en las placas y dejarlas crecer antes de poder usarlas. Estamos interesados ​​en cómopodemos congelar las células en esas placas para que pueda sacarlas del congelador y estén listas para usar ”. El laboratorio de Gibson ha desarrollado algunos materiales que funcionan no afectando el hielo, sino protegiendo eficazmente las células durante este proceso de congelación. 5 “Encontramos estos niveles realmente notables de recuperación celular. Uno de nuestros resultados más emocionantes fue agregar polianfolito a las células en monocapas, adheridas al plástico de cultivo de tejidos, y vimos un aumento dramático de <20% a> 80% delas células que se están recuperando ". 6

Esta investigación sobre la ciencia de la congelación tampoco se limita a las ciencias de la vida; se está aplicando a todo, desde hacer que el helado tenga un sabor más cremoso con menos grasa hasta evitar el daño por congelación-descongelación del concreto. 7

"Si puede hacer que la investigación sea más eficiente, es un gran resultado, pero una investigación como esta también está ayudando a abordar preguntas básicas sobre cómo estas bajas temperaturas están afectando la vida y cómo podemos almacenar las cosas mejor y de manera más eficiente".

Referencias

1. Tavukcuoglu S, Al-Azawi T, Khaki AA, Al-Hasani S, et al. Es el método estándar de vitrificación de criopreservación. Medio Oriente Fertil. Soc. J. 2012; 17: 152–156. Doi: 10.1016 / j.mefs.2012.07.007 .

2. Awan M, Buriak B, Fleck R, et al. Dimetilsulfóxido: un actor central desde los albores de la criobiología, ¿la eficacia se equilibra con la toxicidad? Medicina regenerativa 2020; 15 3 doi: 10.2217 / rme-2019-0145

3. Carpenter JF y Hansen TN. La proteína anticongelante modula la supervivencia celular durante la criopreservación: mediación a través de la influencia sobre el crecimiento de cristales de hielo. Proc Natl Acad Sci EE. UU. . 1992; 89 19: 8953–8957. Doi: 10.1073 / pnas.89.19.8953

4. Hasan M, Fayter AER, Gibson MI. Los polímeros inhibidores de la recristalización del hielo permiten la criopreservación de microorganismos sin glicerol. Biomacromoléculas 2018; 19 8: 3371–3376. Doi: 10.1021 / acs.biomac.8b00660

5. Stubbs C, Bailey TL, Murray K, Gibson M. Polyampholytes como crioprotectores macromoleculares emergentes. Biomacromoléculas 2020; 21 1: 7–17. Doi: 10.1021 / acs.biomac.9b01053

6. Bailey TL, Stubbs C, Murray K, Tomás RMF, Otten L, Gibson MI. Poli anfolito escalable sintéticamente que mejora drásticamente la criopreservación celular. Biomacromoléculas 2019; 20 8: 3104–3114. Doi: 10.1021 / acs.biomac.9b00681

7. Frazier SD, Matar MG, Osio-Norgaard J, Aday AN, Delesky EA, Srubar WV. Inhibición del daño por congelación-descongelación en pasta de cemento y concreto imitando el anticongelante natural. Informes de células sobre ciencias físicas 2020; 1: 100060. Doi: 10.1016 / j.xcrp.2020.100060 .

Conozca al autor
Joanna Owens, PhD
Publicidad