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diversas aplicaciones de cribado de alto contenido y alto rendimiento

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diversas aplicaciones de cribado de alto contenido y alto rendimiento

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Ha habido mucho debate a lo largo de los años sobre las virtudes relativas de cribado fenotípico versus basado en objetivos . Sin embargo, los investigadores del mundo académico y de la industria probablemente estarían de acuerdo en que la mejor opción de tecnología de detección depende en gran medida de las preguntas que está tratando de responder.

Tomemos dos adversarios que actualmente imponen una enorme carga a la humanidad: COVID-19 y el cáncer. El esfuerzo global inmediato para encontrar medicamentos o vacunas eficaces contra el SARS-CoV-2, el virus que causa el COVID-19, requiere una completa diferente conjunto de herramientas para abordar una enfermedad compleja como el cáncer. En este artículo, usamos estos dos ejemplos para ilustrar la gama de herramientas de detección que tenemos al alcance de la mano en la actualidad.

Examen virtual para el descubrimiento de fármacos COVID-19


En la actualidad, los enormes esfuerzos de investigación mundial se centran en comprender el virus SARS-CoV-2 con miras a desarrollar tratamientos o, idealmente, una vacuna. Sin embargo, cuando se impuso el acceso restringido al laboratorio debido al brote de principios de este año, YuWai Chen de la Universidad Politécnica de Hong Kong y sus colegas necesitaban confiar en la detección por computadora para encontrar rápidamente posibles medicamentos contra el virus 1 .

“Nos propusimos buscar opciones de tratamiento basadas en estructuras que se puedan aplicar de inmediato, aprovechando la gran cantidad de investigación farmacológica en respuesta al brote de SARS de 2003”, explicó Chen. “El uso de la detección virtual acelera el proceso al eludirla prolongada producción y purificación de proteínas ”. Con el lanzamiento de la secuencia del genoma del SARS-CoV-2, se reveló su estrecha relación con el coronavirus del SARS anterior y, dado que los virus comparten una alta similitud en la secuencia de proteínas, el equipo confiaba en la calidad desu modelo predicho.

Centraron sus esfuerzos en la proteína viral, proteasa similar a 3C 3CL pro , que es necesario para la replicación.“Predijimos su estructura 3D basándonos en su alta similitud de secuencia 94% de identidad con el ortólogo del SARS-CoV, pero el mayor desafío fue modelar las conformaciones de la cadena lateral de esos residuos“ mutados ”variantes.En la actualidad, ningún software de modelado automatizado hace esto de manera satisfactoria ”, explicó Chen.Después de una ronda de modelado de cadenas laterales, comprobaron y revisaron cada residuo variante de las cadenas A y B, haciendo referencias a las densidades de electrones de la estructura de la plantilla en el banco de datos de proteínas.“Sabíamos que estos residuos variantes no desempeñaban un papel fundamental en la unión del sustrato o la catálisis;sin embargo, no escatimamos esfuerzos para producir el mejor modelo con el rotámero más probable en cada posición ”.

El equipo eligió exclusivamente medicamentos que ya habían recibido la aprobación regulatoria para otras indicaciones como candidatos, porque el objetivo era recomendar opciones terapéuticas que pudieran aplicarse lo más rápido posible. A mediados de febrero, publicaron y recomendaron 16 medicamentos candidatos para reutilizacióncontra COVID-19. “Entre estos, los antivirales ledipasvir o velpatasvir originalmente medicamentos contra el virus de la hepatitis C son particularmente atractivos con efectos secundarios mínimos”, dice Chen. “Sin embargo, también notamos que los medicamentos Epclusa velpatasvir / sofosbuviry Harvoni ledipasvir / sofosbuvir podrían ser muy eficaces porque pueden tener acciones inhibidoras duales sobre dos enzimas virales. El uso de un fármaco con dos dianas puede reducir sustancialmente la probabilidad de que el virus desarrolle resistencia ”.

Para confirmar los resultados computacionales, el siguiente paso es realizar in vitro estudios. “Ahora planeamos estudiar la fuerza de unión e inhibición de nuestros candidatos propuestos al 3CL pro proteína y verificar la unión con estudios estructurales. Si estos estudios de detección bioquímica arrojan resultados positivos, entonces estudiaremos la inhibición del virus en modelos celulares y animales. Con suerte, estos resultados son suficientes para convencer a los médicos de que los candidatos a fármacos valen la penaprobando más. "

Información reciente sobre los epítopos de unión de COVID-19

El nuevo coronavirus, COVID-19, ha sido declarado pandemia por la Organización Mundial de la Salud OMS. A medida que se propaga, los investigadores se movilizan para comprender los mecanismos de unión del virus como un primer paso en el desarrollo de una vacuna.nota de aplicación, descubra ejemplos de la vida real de cómo la interferometría de biocapa y la tecnología de biosensores han contribuido al desarrollo de la vacuna COVID-19, lo que permite a los investigadores evaluar las características de interacción virus-anticuerpo.

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Cribado de alto contenido para biología compleja


en contraste con el lujo de proyectar contra un crítico sencillo proteína diana, muchas de las enfermedades complejas contra las que evaluamos los medicamentos requieren una visión más amplia del fenotipo celular o tisular. Esto ha llevado a un cambio significativo hacia la detección de alto contenido.

En la Universidad de Nottingham, Reino Unido, Tim Self dirige SLIM Imaging Facility y ha visto una mayor demanda de imágenes de alto contenido. “Durante muchos años, nos enfocamos en pantallas de alto rendimiento que consideraban la señalización del segundo mensajero con intensidad comolectura simple. En estos días, podemos tomar múltiples vistas de un pozo, bajo diferentes longitudes de onda de luz y etiquetar diferentes objetivos dentro de una celda. El hecho de que esto ahora sea posible se debe a varios avances clave ".

CUADRO 1: En un microscopio de fluorescencia convencional es decir, de campo amplio, toda la muestra se inunda de manera uniforme con la luz de una fuente de luz. Por el contrario, la microscopía confocal de escáner puntual utiliza un orificio para iluminar solo un área determinada de la muestra.En la microscopía confocal de disco giratorio, un disco con miles de orificios divide la luz láser en la muestra, que luego se recoge de nuevo en el detector. Esto permite una adquisición de imágenes más rápida que un microscopio confocal de escáner de puntos.


La mayoría de las plataformas de imágenes de alto contenido funcionan con fluorescencia y solían ser principalmente sistemas de campo amplio es decir, no microscopía confocal. Además de la tecnología de cámara mejorada que aumentó la calidad, velocidad y sensibilidad de la adquisición de imágenes, uno de los principalesLos avances han sido la innovación de los LED para que pueda tener múltiples canales de excitación, explica Self. “Proporcionan un poco más de potencia de excitación con una conmutación más rápida para experimentos de múltiples longitudes de onda y son algo más baratos de usar. Pero aún no son tan potentes como los láseres- Los láseres siguen siendo un componente clave en muchas plataformas de imágenes de alta gama. Si tiene un disco giratorio Cuadro 1 con un láser, esto le permite adquirir imágenes de forma rápida y suave y evitar que la muestra se decolore y se dañe ”.

El rango de sondas también está aumentando a través de la fluorescencia, mientras que anteriormente esto estaba rezagado con respecto al desarrollo de la tecnología. “Hay muchas más sondas inteligentes que cambiarán su fluorescencia según el entorno en el que se encuentren o la fuente de luz que se les ponga,"Explica Self." Pero otra área que estamos viendo es la obtención de imágenes sin etiquetas de células vivas. Esto implica tomar imágenes de contraste de fase de alta calidad de su población celular para que pueda seguirlas a medida que proliferan y migran ", explicó SelfEsto se ha utilizado para estudiar la cicatrización de heridas, en experimentos de raspado de heridas o colocando espaciadores dentro de los pozos, retirándolos y siguiendo las células en proliferación a medida que se mueven hacia esa área.

Una gran tendencia en imágenes de alto contenido es el avance hacia células cultivadas en 3D y 4D - mirando muestras más gruesas y estudiándolas a lo largo del tiempo. “Anteriormente solo podíamos trabajar con monocapas individuales de células cultivadas, pero ahora queremos mirar mucho más profundamente en las muestras, por ejemplo, si estamos trabajando con esferoides o biopelículas - platelos lectores ahora pueden hacer eso con mucha más precisión y también reconstruir los datos después ”, dice Self.

Mejora de la caja de herramientas de descubrimiento de fármacos: cómo lograr un procesamiento y análisis más eficientes de los datos de detección

A medida que las tecnologías de detección de descubrimiento de fármacos continúan aumentando tanto en capacidad como en complejidad, también lo hace la cantidad de datos a procesar. Los científicos tienen la tarea de encontrar formas de detectar problemas potenciales con moléculas prometedoras en la etapa más temprana posible; lograrlo vienedesde un acceso más rápido a macrodatos y la capacidad de integrar esos datos en un flujo de trabajo eficiente. Descargue este documento técnico para descubrir cómo puede lograr un procesamiento y análisis más eficientes de los datos de detección.

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Reconstrucción de datos de cribado de alto contenido


Esto nos lleva al avance quizás más importante en la detección de alto contenido: la potencia computacional necesaria para analizar con éxito todos los datos. Esto está bien ilustrado por el trabajo que se está llevando a cabo en el laboratorio de Steven Bagley en el Cancer Research UK Manchester Institute.en Alderley Park, Cheshire, que son responsables de la detección de muestras traslacionales por ejemplo, muestras de pacientes o xenoinjertos para 45 a 50 grupos de investigación, muchos de los cuales ahora quieren obtener imágenes de alto contenido de muestras 3D a lo largo del tiempo y en diferentes condiciones fisiológicamente relevantes.

“Desde aproximadamente 2008, mi misión ha sido intentar describir numéricamente los datos lo más fácilmente posible para los equipos dentro del Instituto. Luchamos durante mucho tiempo, porque no había muchas herramientas para hacer 3D de alto contenido yAnálisis 4D ”. Aunque la potencia computacional ha aumentado y hay más herramientas de análisis disponibles, la mayoría de los paquetes que existen para el análisis 3D a menudo tienen dificultades para realizar análisis por lotes de todos los pozos en todos los campos y unir todos esos datos, explica Bagley.

“Si considera que un pozo de 96 se compone de 25 campos de visión, y queremos unirlos todos en 3D, y luego hacer el análisis en ese volumen ... computacionalmente, eso se vuelve extremadamente difícil, especialmente cuandotambién puede haber cuatro canales de fluorescencia. Hacer eso en 60 pocillos y luego en 30 placas es un gran problema ".

Una de las cosas que están explorando con los científicos computacionales del instituto es desarrollar una plataforma de inteligencia artificial IA que pueda llevar a cabo el análisis fenotípico. En Nottingham, también están entusiasmados con el potencial de este enfoque. “El avance enel aprendizaje automático y el avance hacia la inteligencia artificial para que pueda entrenar su software para buscar ciertas características tiene el potencial de proporcionar grandes avances en lo que podemos hacer ”, dice Self.

Una de las claras ventajas de usar imágenes de alto contenido es que elimina el sesgo del usuario que viene con la microscopía tradicional. "Cuando estoy enseñando a los estudiantes, digo que la razón por la que la detección de alto contenido es mucho mejor es queelimina el sesgo del usuario que se infiltra si selecciona personalmente regiones en una diapositiva porque ve una célula que se ajusta a la morfología que está buscando ", dice Self. Esto es especialmente cierto en la investigación del cáncer, concuerda Bagley, donde están buscandoen el microambiente tumoral . “Muy a menudo son las celdas fragmentadas y las que no son bonitas las que te darán mucha más información. Por eso necesitamos poder capturar todas las celdas en tres dimensiones y todo a lo largo del tiempo también.no solo las células tumorales que crecen en 3D, sino las células que las rodean, que son importantes a la hora de estudiar tratamientos como la inmunoterapia, por ejemplo ”.

Otro cambio que se ha producido naturalmente a medida que los investigadores pasan a la detección de alto contenido es el rendimiento. "En lugar de optar por lo que llamamos la" agricultura "de datos de alto contenido y hacer placas de 384 y 1000+ pozos, tendemos a permanecer por debajo de 96porque necesitamos espacio de crecimiento y tiempo para que las células interactúen. Algunas de las imágenes utilizan lentes de bajo aumento para escanear las células del paciente en busca de células tumorales circulantes y pueden adquirir imágenes de 60 pocillos en 20 o 30 minutos. En otros casos, es necesariobajar a 48 pozos porque algunos de los esferoides y organoides crecemos son bastante grandes ”. En estos escenarios, los brazos robóticos y las incubadoras automatizadas permiten un análisis rápido de varias placas durante cinco o seis días y permiten a los investigadores obtener imágenes de procesos como la vida útil de los fármacos o el desarrollo de organoides.Si queremos ver solo una pequeña instantánea en el tiempo o un principio o un final, también queremos ver todas las fases individuales que conducen a ese producto final, explica Bagley.

Citometría de flujo avanzada: análisis rápido para modelos complejos basados ​​en células

Los avances en nuestra comprensión de la biología celular y las tecnologías de ensayo han dado lugar al uso de ensayos basados ​​en células mucho antes en el flujo de trabajo de descubrimiento de fármacos. Esto crea un desafío importante para los laboratorios; los enfoques tradicionales basados ​​en células no están diseñados para el alto rendimientodetección de demandas de identificación de candidatos en etapa temprana. Por lo tanto, los laboratorios deben encontrar nuevas formas de trabajar para hacer frente a las necesidades de los canales de descubrimiento de fármacos modernos. Descargue este documento técnico para descubrir una solución rápida y de alto rendimiento para ensayos de detección basados ​​en células.

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Necesidades futuras


La brecha en el mercado, dice Bagley, es multiplexar tantas etiquetas como sea posible. "Por el momento, nos quedamos con el uso de tal vez cuatro o cinco colores. La mayoría de nuestras muestras son valiosas y es importante para nosotros obtenertantas etiquetas como sea posible y hacen preguntas complicadas de coubicación. En este momento, no hay suficientes etiquetas o láseres para llenar la paleta de colores. Estamos explorando si podemos abordar esto mediante tecnología alternativa, mejores filtros o diferentes formas derecopilar los datos. En última instancia, nuestras muestras provienen de pacientes, por lo que queremos hacer el mejor uso de ellos ".

referencia


1. Chen YW, Yiu CB y Wong KY. 2020. Predicción de la estructura de la proteasa similar a 3C del SARS-CoV-2 2019-nCoV 3CL pro: la detección virtual revela velpatasvir, ledipasvir y otros candidatos a la reutilización de fármacos. F1000Res. DOI: 10.12688 / f1000research.22457.2. ECollection 2020.

Conozca al autor
Joanna Owens, PhD
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