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Caracterización mejorada de conjugados anticuerpo-fármaco

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Caracterización mejorada de conjugados anticuerpo-fármaco

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Los conjugados anticuerpo-fármaco ADC son una clase emergente de terapias, que comprenden un anticuerpo monoclonal ligado a un fármaco de molécula pequeña. La capacidad de dirigir los efectos citotóxicos a un subconjunto de células sin afectar a otras las convierte en una opción de tratamiento atractiva para enfermedades comocomo cáncer. Sin embargo, el análisis de ADC, un paso clave tanto en el desarrollo preclínico como en el control de calidad, puede ser difícil y existe la necesidad de mejorar los métodos de análisis.

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nuevo estudio de investigación publicado en Química analítica , científicos de la Universidad de Wisconsin muestran un método novedoso basado en espectrometría de masas que permite la caracterización de alto rendimiento de los ADC.

Redes tecnológicas
habló con Eli J. Larson, autor principal del artículo y candidato a doctorado en el Laboratorio de Ge , para obtener más información sobre el método y algunos de los beneficios que ofrece sobre las técnicas analíticas existentes. En esta entrevista, Eli también explica cómo se están aplicando los ADC como terapias contra el cáncer y destaca los desafíos clave que enfrentan para garantizar su seguridad y eficacia.

Ash Board AB: ¿Cómo se aplican los ADC como terapias contra el cáncer y cuáles son los beneficios clave?

Eli J. Larson EL :
En este momento, la aplicación más común de los ADC en el tratamiento contra el cáncer es como medicamento de último recurso. Diez de los 11 ADC actualmente aprobados por la FDA se utilizan para tratar a pacientes que no responden a las terapias tradicionales contra el cáncer o pacientes con cánceres en recaída o refractarios.Los ADC son la combinación de dos restos terapéuticos: los fármacos de molécula pequeña y los anticuerpos monoclonales mAb. Los fármacos de molécula pequeña muestran altos niveles de citotoxicidad y matan eficazmente las células cancerosas; sin embargo, a menudo producen efectos secundarios perjudiciales para los pacientes. Por el contrario, los mAbs presentan una menor citotoxicidadniveles que los medicamentos de molécula pequeña, pero la naturaleza dirigida de los mAbs limita los efectos secundarios del paciente. La combinación de estos restos en un ADC permite conservar las fortalezas de ambas entidades terapéuticas mientras que las debilidades disminuyen, lo que convierte a los ADC en "soluciones mágicas" para aplicaciones contra el cáncer.

AB: ¿Cuáles son algunos de los desafíos para garantizar la seguridad y eficacia de los ADC?

EL :
Dos desafíos clave para el análisis de ADC son la complejidad molecular y el tamaño de los ADC. Cualquier tratamiento basado en anticuerpos debe evaluar la gran cantidad de factores que se sabe que afectan la farmacocinética, la eficacia de unión y la estabilidad. Estos incluyen variantes de secuencia primaria, lisina C-terminalrecorte, desamidación, variantes de glicosilación, oxidación y muchos otros. El proceso de conjugación de fármacos agrega complejidad como resultado de la variación de las proporciones de fármaco a anticuerpo DAR, isómeros posicionales de fármaco debido a la conjugación estocástica de fármaco y posible conjugación en regiones no deseadas del mAb comocomo región determinante complementaria. Para los análisis que utilizan la detección por espectrometría de masas MS, la relación señal-ruido de un analito determinado disminuye con el aumento del tamaño del analito. Los ADC son entidades moleculares relativamente grandes, de aproximadamente 150 kDa de masa, que pueden realizar análisis deLos ADC dificultan y dificultan específicamente la detección de variantes de baja abundancia del ADC.

AB: ¿Cuáles son algunos de los métodos comunes que se utilizan para evaluar los atributos de calidad de los ADC? ¿Existen inconvenientes asociados con estos métodos?

EL :
Los métodos más utilizados para el análisis de ADC son la cromatografía líquida ascendente acoplada a MS en tándem LC-MS2 y LC-MS2 intermedia descendente. El análisis ascendente utiliza una digestión enzimática extensa con proteasas como tripsina o Lys-Cpara producir fragmentos de péptidos del ADC <3 kDa antes del análisis LC-MS2. El proceso de digestión ascendente es generalmente una reacción nocturna que requiere mucho tiempo y puede inducir una modificación artificial del ADC durante el proceso de digestión y preparación de la muestra., las diferencias de eficiencia de ionización entre péptidos modificados y no modificados hacen que la cuantificación de las características moleculares globales, como las variantes de glicoforma y el DAR promedio, sea difícil de lograr.proteasa como IdeS o KGP seguida de reducción química para producir subunidades de ~ 25 kDa de tamaño. Esto permite la cuantificación fácil de variantes de modificación global como glicoformas y DAR promedio porLC-MS, pero el tiempo de preparación de la muestra y el tiempo de análisis LC-MS2 todavía es de ~ 3 horas.Otros métodos, como la cromatografía de interacción hidrofóbica acoplada a detectores UV, permiten la determinación de DAR a partir del ADC intacto, antes del largo procedimiento de digestión de la muestra, pero las condiciones del tampón son incompatibles con MS y los atributos de calidad adicionales no se pueden monitorear fácilmente.

AB: Su grupo ha desarrollado un método rápido y de alto rendimiento para el análisis de atributos múltiples de ADC de cisteína. ¿Puede explicar cómo se logró esto?

EL :
Nuestro objetivo al diseñar este método fue desarrollar un diagnóstico rápido para los ADC para informar a los usuarios si es necesaria o no una caracterización adicional del ADC. Para que este método sea realmente rápido, necesitábamos: 1 Reducir o eliminar la preparación de la muestratiempo, 2 Reducir o eliminar el tiempo necesario para las separaciones de front-end, 3 Mejorar la sensibilidad de MS y la relación señal-ruido S / N, y 4 Aumentar la amplitud de la información recopilada durante el análisis de MS.Para lograr esto, optamos por utilizar la espectrometría de masas descendente, que no utiliza la digestión enzimática antes del análisis de MS, eliminando la mayor contribución individual al tiempo de preparación de la muestra.Debido a que el modelo de ADC ligado a cisteína se mantiene unido completamente por interacciones no covalentes para ciertos valores de DAR, nuestro único paso de preparación de la muestra es la dilución del ADC en tampón no desnaturalizante compatible con MS.Para eliminar la necesidad de LC antes de MS, utilizamos la separación de fase gaseosa en forma de espectrometría de movilidad de iones atrapados TIMS.TIMS permite medir la sección transversal de colisión CCS de los analitos y aumenta la sensibilidad a través de una relación S / N mejorada.Si bien el uso de TIMS ya aumenta la amplitud de la información recopilada en relación con los métodos convencionales, el aumento de la disociación inducida por colisión CID en la fuente y las energías CID de la celda de colisión permiten la detección de la masa ADC intacta MS1, la masa de la subunidad ADC intacta MS2 y análisis de secuencia primaria MS3.TIMS combinado con un enfoque de MS de tres niveles proporciona una mayor amplitud de información que los métodos tradicionales, específicamente a través de la recopilación de la masa de ADC intacta y la determinación de los valores de CCS para el ADC.Aunque las técnicas anteriores pueden proporcionar una mayor cobertura de secuencia primaria que nuestro método desarrollado, nuestra técnica proporciona la información necesaria para que los usuarios determinen si se justifica o no un método analítico más extenso.

AB: ¿Qué beneficios proporciona esto sobre las técnicas analíticas existentes que se utilizan para analizar los ADC?

EL :
Las principales ventajas que tiene nuestro método sobre las técnicas tradicionales son la velocidad de análisis y la amplitud de la información proporcionada. Si bien las técnicas anteriores han utilizado procedimientos de digestión prolongados y LC-MS de una a dos horas, nuestro método se puede aplicar simplemente diluyendo el analito enTampón compatible con MS como acetato de amonio, lo que hace que el ciclo de trabajo de análisis sea funcionalmente igual al tiempo de análisis instrumental. La adición de CCS y masa de ADC intacta a la masa de subunidades y la caracterización de la secuencia primaria realizada en métodos tradicionales ofrecen una mayor amplitud de información en menos tiempo quetécnicas tradicionales. Una ventaja menor distintiva de nuestro método es el uso de un instrumento sin modificaciones, disponible comercialmente. Este instrumento se está utilizando ampliamente para realizar análisis LC-MS2 de abajo hacia arriba y nuestro método muestra que las capacidades de este instrumento son mucho mayores quemuchos usuarios pueden ser conscientes.

AB: ¿Cómo se puede utilizar este enfoque para la caracterización de terapias basadas en anticuerpos en el control de calidad pre y posclínico?

EL :
La técnica se puede utilizar en el control de calidad preclínico y posclínico para monitorear rápidamente la variabilidad de un lote a otro en terapias basadas en anticuerpos.Los resultados generados a partir de este método proporcionan una hoja de ruta de los atributos terapéuticos que muestra a los profesionales si existen más detalles moleculares.Es necesario. Imagino que algún día este método se podrá utilizar en un flujo de trabajo de bioprocesamiento continuo en línea gracias a la velocidad, la amplitud de la información proporcionada y la facilidad de interactuar con los dispositivos automatizados de manipulación de muestras.

Eli J. Larson estaba hablando con Ash Board, director editorial de Technology Networks.

Conozca a los autores
Doctorado en Ash Board
Director editorial
Anna MacDonald
Escritor científico
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